Percoll細胞分離液說明書 Percoll細胞分離液說明書 Percoll細胞分離液說明書 Percoll細胞分離液說明書 Percoll細胞分離液說明書
一、原理 Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低(<20mosm/kg H2O), 粘度也很小，可形成高達1.3g/ml密度，采用預先形成的密度梯度時可在低離心力(200～1000g)于數分至數十分鐘內達到滿意的細胞分離結果。由于GE percoll PLUS **細胞分離液擴散常數低，所形成的梯度十分穩定。此外，GE percoll PLUS **細胞分離液不穿透生物膜，對細胞無毒害，因此廣泛用于分離細胞、亞細胞成分、**及病毒，還可將受損細胞及其碎片與完好的活細胞分離。 二、操作方法及注意事項 1. 不同濃度(密度)Percoll溶液的制備: 先用9份Percoll與1份8.5%NaCl或1.5MPBS混合達到生理性滲透壓，然后用生理溶液(0.85% NaCl或0.15M PBS)稀釋到所需濃度。 Percoll濃度(%)： 70 60 50 40 30 20 比重g/ml ： 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031 2. 不連續密度梯度Percoll層的制備: 先將試管壁用牛血清濕潤，除去多余血清，這種預處理可使逐層疊加的Percoll液平穩沿管壁流下，使形成滿意的界面。在制備過程中一般用長針頭注射器從高密度向低密度逐層放置，有時相鄰兩層Percoll比重相差不大時，可將GE percoll PLUS **細胞分離液放入注射器中，小針頭斜面緊貼管壁，任其自然慢慢流下。 3. 裝樣：樣品體積和細胞濃度根據不同細胞而異，一般加樣體積不宜過大，細胞濃度也不可過高，否則會影響細胞的分離和回收。 4. 離心：一般采用離心力為400g，時間20～25min。由于多層Percoll之間密度差別不大，因此離心機加速、降速時要慢，要平穩。 5. 取樣：當所要分離的細胞絕大部分在兩層的界面時，可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細胞；有時大部分細胞位于Percoll層中，則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細胞經2次洗滌后可供培養或檢測用。 三、分離純化細胞舉例 1. 富含NK活性大顆粒**細胞(LGL)的純化:按順序由下向上逐層加50%、47.5%、45%、42.5%和40%五種不同密度的Percoll,如用10ml試管(或塑料管)分離,每層Percoll約1.2～1.5ml，初步從外周血中分離的PBMC細胞1×108懸于1ml培基中，按要求裝樣、離心和取樣。一般富含NK殺傷活性的LGL細胞位于42.5%與45%Percoll界面以及上下二層的Percoll液中。 2. 純化**母細胞和除**細胞：分別疊加50%和30%Percoll液。收取經PHA(或其它抗原、有絲分裂原)刺激PBMC,或含有較高比例異型的PBMC(如腎綜合征出血熱患者)，按要求裝樣、離心和取樣。位于管底的**細胞為小**細胞；兩層Percoll之間為**母細胞，純度和回收率在80%以上，位于30%Percoll表面是死細胞。收獲**母細胞可進行表型、結構以及功能的研究。 四、人不同血細胞的漂浮密度 細 胞 漂浮密度 細 胞 漂浮密度 紅細胞 1.09-1.11 **細胞 1.052-1.077 嗜酸性粒細胞 1.09-1.095 B**細胞 1.062-1.075 嗜中性粒細胞 1.080-1.085 T**細胞 1.065-1.077 單核細胞 1.050-1.066 **母細胞 1.065-1.077 血小板 1.030-1.060 自然殺傷細胞 1.050-1.070 五、GE percoll PLUS **細胞分離液相關問題 問：percoll連續梯度怎么配制？比如15%---75%的percoll連續梯度? 答：根據實驗需要的具體密度梯度決定的，根據要分離的不同細胞種類，數量等等，也有用原液配的。也有用80%配的，不一定的。另外，percoll本身是低滲透壓的，要用高滲透壓溶液配成生理等滲透壓溶液，然后使用，不然，細胞容易破裂。一般是先用9份Percoll與1份8.5%NaCl或1.5MPBS混合達到生理性滲透壓，然后用生理溶液(0.85% NaCl或0.15M PBS)稀釋到所需濃度。即取Percoll原液與10倍濃縮的PBS以9:1的比例混合，此時溶液為100%Percoll，比重是1.127，毫克分子滲透壓濃度為290mOsmol/kg