Percoll细胞分离液说明书 Percoll细胞分离液说明书 Percoll细胞分离液说明书 Percoll细胞分离液说明书 Percoll细胞分离液说明书
一、原理 Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20mosm/kg H2O), 粘度也很小，可形成高达1.3g/ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于GE percoll PLUS **细胞分离液扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，GE percoll PLUS **细胞分离液不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、**及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。 二、操作方法及注意事项 1. 不同浓度(密度)Percoll溶液的制备: 先用9份Percoll与1份8.5%NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85% NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。 Percoll浓度(%)： 70 60 50 40 30 20 比重g/ml ： 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031 2. 不连续密度梯度Percoll层的制备: 先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将GE percoll PLUS **细胞分离液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。 3. 装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。 4. 离心：一般采用离心力为400g，时间20～25min。由于多层Percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。 5. 取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞；有时大部分细胞位于Percoll层中，则需要逐层收集。收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。 三、分离纯化细胞举例 1. 富含NK活性大颗粒**细胞(LGL)的纯化:按顺序由下向上逐层加50%、47.5%、45%、42.5%和40%五种不同密度的Percoll,如用10ml试管(或塑料管)分离,每层Percoll约1.2～1.5ml，初步从外周血中分离的PBMC细胞1×108悬于1ml培基中，按要求装样、离心和取样。一般富含NK杀伤活性的LGL细胞位于42.5%与45%Percoll界面以及上下二层的Percoll液中。 2. 纯化**母细胞和除**细胞：分别叠加50%和30%Percoll液。收取经PHA(或其它抗原、有丝分裂原)刺激PBMC,或含有较高比例异型的PBMC(如肾综合征出血热患者)，按要求装样、离心和取样。位于管底的**细胞为小**细胞；两层Percoll之间为**母细胞，纯度和回收率在80%以上，位于30%Percoll表面是死细胞。收获**母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。 四、人不同血细胞的漂浮密度 细 胞 漂浮密度 细 胞 漂浮密度 红细胞 1.09-1.11 **细胞 1.052-1.077 嗜酸性粒细胞 1.09-1.095 B**细胞 1.062-1.075 嗜中性粒细胞 1.080-1.085 T**细胞 1.065-1.077 单核细胞 1.050-1.066 **母细胞 1.065-1.077 血小板 1.030-1.060 自然杀伤细胞 1.050-1.070 五、GE percoll PLUS **细胞分离液相关问题 问：percoll连续梯度怎么配制？比如15%---75%的percoll连续梯度? 答：根据实验需要的具体密度梯度决定的，根据要分离的不同细胞种类，数量等等，也有用原液配的。也有用80%配的，不一定的。另外，percoll本身是低渗透压的，要用高渗透压溶液配成生理等渗透压溶液，然后使用，不然，细胞容易破裂。一般是先用9份Percoll与1份8.5%NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85% NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。即取Percoll原液与10倍浓缩的PBS以9:1的比例混合，此时溶液为100%Percoll，比重是1.127，毫克分子渗透压浓度为290mOsmol/kg