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組織切片的制備
組織切片的制備

（一）石蠟切片的制備
1.及時固定組織：應采用10%~20%甲醛液（10%甲醛液即用濃甲醛液1份加蒸餾水9份稀釋）固定組織，因甲醛易氧化成甲酸，因此多會偏酸性，*理想的是配成中性甲醛液。巨大組織要切開固定，小塊組織的固定時間約4小時左右，然后取材時修切成大小約22x22mm，厚不超過2mm的組織塊進行脫水。取材時必須注意核對編號是否與送檢單上的病理號一致，并記錄好對大體標本的描述，取材組織的形狀和數量。
2.脫水徹底：脫水液常用乙醇，用乙醇脫水要由低濃度逐級上行至高濃度（一般70%~100%的濃度），逐步置換組織內的水份。組織在乙醇脫水時，低濃度乙醇的時間可適當延長，高濃度乙醇脫水時間不能過長。
3. 透明充分: 透明液多采用二甲苯，組織脫水后轉入二甲苯，依據組織的大小、厚薄，約置30~90分鐘。
4. 浸蠟足夠:浸蠟多用純凈而熔點稍低(56~58度)的石蠟，浸蠟時采用三級或四級，以盡量**二甲苯。浸蠟時間依據組織大小厚薄而定，一般為1~2少時。浸蠟時包埋機所設定的溫度應比所用石蠟熔點稍高以保持石蠟恰在熔溶狀態。這樣，組織才能取得良好的浸蠟效果。如浸蠟溫度過高，導致組織收縮，變硬變脆，難以切出理想切片。
5.包埋恰當:包埋時，包埋石蠟的溫度要比組織高(約3~5度)，否則包埋冷凝后組織與包埋石蠟分離，特別是在冷天包埋時，動作更要迅速，否則容易導致組織與石蠟融合不好，影響切片。包埋是時把組織*大*平切面或所需是病灶切面向下，對皮膚、腸管和囊壁等層次清楚的組織其切面應包含有各層組織。
組織包埋完后，要與取材時記錄的組織形狀和數量核對，發現問題，及時解決。
6.切片要薄:切片首要任務是把切片刀研磨鋒利，這是能否切薄而平整切片的關鍵。其次要把刀架上的切片**角調至2~5度，在此角范圍內，才能切出良好蠟片。如使用一次性刀片，可轉動刀座上的弧形刻度盤選取*合適的刻度(該合適刻度并不等于真正的切片**角)。切片前要把切片機上有關的各螺旋擰緊，如沒有擰緊或包埋少組織蠟塊過硬時就會出現跳片，使蠟片成一截厚一截薄。切片的厚度應為3~4μm，對一些組織如**結、鼻咽和扁桃體，切片的厚度應為2~3μm。
7.貼片烤片：切出的蠟片應放在恒溫貼片盆內展開，并根據所用包埋石蠟的溫度調節水溫在42~46度左右。為了利于展平蠟片，可先把蠟片放在一缸缸約10~15%乙醇內，然后用玻片再將蠟片移至恒溫貼片盆，由于水的表面張力比乙醇大，蠟片由乙醇移至水后就很容易展平。貼片時再注意“定點”和“定向”。*后即可置入約60~65度的烤片箱內烤15~30分鐘，也可放在熱板上烘干，蠟片就可牢固地粘附在載玻片或蓋玻片上。
8．切片在染色前必須脫蠟干凈：未完全脫蠟的組織切片，染色后組織和細胞模糊不清。脫蠟要用兩級或三級脫蠟劑如二甲苯，時間為10~20分鐘，應視所用二甲苯的新舊以及室溫情況而定。脫蠟時間寧可長些，不應過短。
9.蘇木素染液一定要配好:蘇木素液配制的好壞，決定染色的優劣。蘇木素配制有多種配方，關鍵在于氧化。如加氧化汞作氧化劑時，要防止氧化過度，同時注意形成的氧化膜污染切片。加碘酸鈉作氧化劑時，就無需把蘇木素液煮沸。要配制自然成熟的蘇木素則不需加氧化劑，但要較長時間才能氧化成熟。不同蘇木素染液的染色時間為5~20分鐘，自然氧化成熟的蘇木素液染色時間可以更長。
（二）冰凍切片的制備
1.取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費時，大者難以切完整，*好為24×24×2mm。
2.取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺上，冰凍。小組織的應先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個小臺后，再放上細小組織，滴上包埋劑。
3.將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機持承器上，啟動粗進退鍵，轉動旋鈕，將組織修平。
4.調好欲切的厚度，根據不同的組織而定，原則上是細胞密集的薄切，纖維多細胞稀的可稍為厚切，一般在5～10um間。
5.調好防卷板。制作冰凍切片，關鍵在于防卷板的調節上，這就要求操作者要細心，準確地將其調較好，調校至適當的位置。切片時，切出的切片能在**時間順利地通過刀防卷板間的通道，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時便可掀起防卷板，取一載玻片，將其附貼上即可。
6.應視不同的組織選擇不同的冷凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根據不同的組織而定，不能一概而論。如：切未經固定的腦組織，肝組織和**結時，冷凍箱中的溫度不能調太低，在-10--15℃左右，切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時，可調在-15～20℃左右，切帶脂肪的組織時，應調至-25℃左右，切含大量的脂肪時，應調至-30℃。
優點
1．簡便，可以不需要對組織固定、脫水、透明、包埋等手續即可進行切片，減少了一些中間環節
冰凍切片時的注意事項
　　①防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應保持干凈，需經常用毛筆挑除切片殘余和用柔軟的紙張擦。有時需要每切完一張切片后就用紙擦一次。因為這個地方是切片通過和附貼的地方，如果有殘余的包埋劑粘于刀或板上，將會破壞甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。
　　②多例多塊組織同時需做冰凍切片時，可各自放于不同的支承器上，于冷凍臺上凍起來，然后依據不同的編號，依序切片，這樣做既不費時也不會亂。
　　③放置組織冰凍前，應視組織的形狀及走勢來放置，所謂“砍柴看柴勢”，切片也是如此，如果胡亂放置，就不能收到很好的效果。
　　④組織塊不須經各種固定液固定，尤其是含水的固定液，在未達到固定前，更不能使用。臨床快速冰凍切片，不須要預先固定，一是為了爭取時間，二是固定了的組織，反而增加了切片的難度。如果使用未完全固定的組織做冰凍切片，就會出現冰晶。這是因為含水的固定液在組織未經固定前，其中的水份也可滲入到組織中去，當冰凍發生時，這些水份就存留于組織中，形成了冰晶。
　　⑤當切片時，如果發現冰凍過度時，可將冰凍的組織連同支承器取出來，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，再行切片。另者，調高冰凍點。
　　⑥用于附貼切片的載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因為當附貼切片時，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時，由于兩種物質間溫度的差別，當它們碰撞在一起時，分子彼此間發生轉移而產生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來附貼切片，由于溫度相同，沒有發生上述的現象。
冰凍切片的快速染色法
　　冰凍切片附貼于載玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分鐘后即可染色。以往，為了防止切片脫落，當切片附貼于載玻片后，即用電吹風吹干后再固定。根據實驗對比認為這種做法欠妥未經固定的切片，強熱作用后，蛋白發生變性，核內含有的物質由于熱的作用融合在一起，染色后鏡下分辨不出核內的各種物質。冰凍切片附貼于載玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，這樣可以使切片中細胞內各種物質都在沒有任何變化的情況下被固定起來，核染色質清晰，核仁明顯，其他物質都完好保存。
　　方法：
　　① 切片固定30秒－1分鐘。
　② 水洗。
（三）細胞爬片的制備
1 載玻片的處理：用肥皂水將載玻片洗凈，自來水沖洗，晾干，再將載玻片
浸泡在洗液中2~3 小時，取出后再用自來水沖凈，蒸餾水沖洗三遍，用干凈的紗
布將載玻片擦干，放在飯盒中，置170℃干烤5 小時****。
2.細胞爬片培養
取原代細胞一瓶，用吸管吸除培養瓶內舊培養液，向培養瓶內加入2ml 0.25%胰蛋白酶,覆滿瓶底。室溫放置5分鐘后鏡下觀察，發現細胞變圓、細胞間隙增大后，立即終止消化，翻轉培養瓶，使瓶底向上。將胰蛋白酶吸去，加入約2ml含10%胎牛血清的DMEM 培養基，將細胞從瓶壁上吹打下來，制成細胞懸液，滴于已處理好的載玻片上，每張片子1~2滴，注意:滴于載玻片后1/3 的位置，且不能有汽泡。放在37℃ 5%CO2培養箱中繼續培養過夜。
3 細胞的固定
將已培養過夜的細胞爬片從5%CO2 培養箱取出，用PBS 將培養液洗去，放在冷乙醇中室溫固定30分鐘后，取出爬片放置在切片盒內-20℃儲存，待**組
化染色。
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