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组织切片的制备
组织切片的制备

（一）石蜡切片的制备
1.及时固定组织：应采用10%~20%甲醛液（10%甲醛液即用浓甲醛液1份加蒸馏水9份稀释）固定组织，因甲醛易氧化成甲酸，因此多会偏酸性，*理想的是配成中性甲醛液。巨大组织要切开固定，小块组织的固定时间约4小时左右，然后取材时修切成大小约22x22mm，厚不超过2mm的组织块进行脱水。取材时必须注意核对编号是否与送检单上的病理号一致，并记录好对大体标本的描述，取材组织的形状和数量。
2.脱水彻底：脱水液常用乙醇，用乙醇脱水要由低浓度逐级上行至高浓度（一般70%~100%的浓度），逐步置换组织内的水份。组织在乙醇脱水时，低浓度乙醇的时间可适当延长，高浓度乙醇脱水时间不能过长。
3. 透明充分: 透明液多采用二甲苯，组织脱水后转入二甲苯，依据组织的大小、厚薄，约置30~90分钟。
4. 浸蜡足够:浸蜡多用纯净而熔点稍低(56~58度)的石蜡，浸蜡时采用三级或四级，以尽量**二甲苯。浸蜡时间依据组织大小厚薄而定，一般为1~2少时。浸蜡时包埋机所设定的温度应比所用石蜡熔点稍高以保持石蜡恰在熔溶状态。这样，组织才能取得良好的浸蜡效果。如浸蜡温度过高，导致组织收缩，变硬变脆，难以切出理想切片。
5.包埋恰当:包埋时，包埋石蜡的温度要比组织高(约3~5度)，否则包埋冷凝后组织与包埋石蜡分离，特别是在冷天包埋时，动作更要迅速，否则容易导致组织与石蜡融合不好，影响切片。包埋是时把组织*大*平切面或所需是病灶切面向下，对皮肤、肠管和囊壁等层次清楚的组织其切面应包含有各层组织。
组织包埋完后，要与取材时记录的组织形状和数量核对，发现问题，及时解决。
6.切片要薄:切片首要任务是把切片刀研磨锋利，这是能否切薄而平整切片的关键。其次要把刀架上的切片**角调至2~5度，在此角范围内，才能切出良好蜡片。如使用一次性刀片，可转动刀座上的弧形刻度盘选取*合适的刻度(该合适刻度并不等于真正的切片**角)。切片前要把切片机上有关的各螺旋拧紧，如没有拧紧或包埋少组织蜡块过硬时就会出现跳片，使蜡片成一截厚一截薄。切片的厚度应为3~4μm，对一些组织如**结、鼻咽和扁桃体，切片的厚度应为2~3μm。
7.贴片烤片：切出的蜡片应放在恒温贴片盆内展开，并根据所用包埋石蜡的温度调节水温在42~46度左右。为了利于展平蜡片，可先把蜡片放在一缸缸约10~15%乙醇内，然后用玻片再将蜡片移至恒温贴片盆，由于水的表面张力比乙醇大，蜡片由乙醇移至水后就很容易展平。贴片时再注意“定点”和“定向”。*后即可置入约60~65度的烤片箱内烤15~30分钟，也可放在热板上烘干，蜡片就可牢固地粘附在载玻片或盖玻片上。
8．切片在染色前必须脱蜡干净：未完全脱蜡的组织切片，染色后组织和细胞模糊不清。脱蜡要用两级或三级脱蜡剂如二甲苯，时间为10~20分钟，应视所用二甲苯的新旧以及室温情况而定。脱蜡时间宁可长些，不应过短。
9.苏木素染液一定要配好:苏木素液配制的好坏，决定染色的优劣。苏木素配制有多种配方，关键在于氧化。如加氧化汞作氧化剂时，要防止氧化过度，同时注意形成的氧化膜污染切片。加碘酸钠作氧化剂时，就无需把苏木素液煮沸。要配制自然成熟的苏木素则不需加氧化剂，但要较长时间才能氧化成熟。不同苏木素染液的染色时间为5~20分钟，自然氧化成熟的苏木素液染色时间可以更长。
（二）冰冻切片的制备
1.取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，*好为24×24×2mm。
2.取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。
3.将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
4.调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。
5.调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在**时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。
6.应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和**结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10--15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。
优点
1．简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节
冰冻切片时的注意事项
　　①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。
　　②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。
　　③放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。
　　④组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。
　　⑤当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。
　　⑥用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。
冰冻切片的快速染色法
　　冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定。根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物质。冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，核染色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。
　　方法：
　　① 切片固定30秒－1分钟。
　② 水洗。
（三）细胞爬片的制备
1 载玻片的处理：用肥皂水将载玻片洗净，自来水冲洗，晾干，再将载玻片
浸泡在洗液中2~3 小时，取出后再用自来水冲净，蒸馏水冲洗三遍，用干净的纱
布将载玻片擦干，放在饭盒中，置170℃干烤5 小时****。
2.细胞爬片培养
取原代细胞一瓶，用吸管吸除培养瓶内旧培养液，向培养瓶内加入2ml 0.25%胰蛋白酶,覆满瓶底。室温放置5分钟后镜下观察，发现细胞变圆、细胞间隙增大后，立即终止消化，翻转培养瓶，使瓶底向上。将胰蛋白酶吸去，加入约2ml含10%胎牛血清的DMEM 培养基，将细胞从瓶壁上吹打下来，制成细胞悬液，滴于已处理好的载玻片上，每张片子1~2滴，注意:滴于载玻片后1/3 的位置，且不能有汽泡。放在37℃ 5%CO2培养箱中继续培养过夜。
3 细胞的固定
将已培养过夜的细胞爬片从5%CO2 培养箱取出，用PBS 将培养液洗去，放在冷乙醇中室温固定30分钟后，取出爬片放置在切片盒内-20℃储存，待**组
化染色。
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