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外周血**細胞分離液使用及原理

    早期分離白細胞的方法,會用一種化合物混合血液。此化合物能夠聚集紅細胞,只輕微影響白細胞。通過離心,紅細胞由于密度增加而聚集沉淀,同時從離心管內上層收集白細胞。

Böyum提出了一種更方便快速的分離方法,即以Ficoll®-甲泛影鈉溶液為介質進行離心。稀釋的血液在Ficoll-甲泛影鈉溶液中分層,之后低速短時離心。紅細胞和多形核粒細胞沉降到管底,單個核細胞(**細胞)和血小板可以從兩個分層間的分界面處收集。

    許多研究者不斷改進了Böyum方法,對于MP生物醫學公司生產的LSM,其方法的獨特之處在于成功運用泛影酸鈉代替了甲泛影鈉。

程序原理:


    去纖維蛋白或肝素化人血以11的比例用生理鹽水或平衡鹽溶液稀釋,在分離溶液中分層,低速離心30min。離心過程中,由于差速遷移*終形成不同的細胞層。

    聚集在管底的顆粒主要是紅細胞和多形核粒細胞,它們通過梯度遷移至管底。由于其密度不同,**細胞和其他單個核細胞(單核細胞和血小板)分布在血漿和LSM兩層之間。**細胞可以通過吸取分界層溶液回收,*后進一步清洗去除血小板,LSM和血漿。

使用說明:


    以下的操作步驟是*初由Böyum.設計的程序中眾多改良版本的一種。此程序經改良用于去纖維蛋白或抗凝血劑處理過的人體血液;對于其他物種或者其他組織的血液,改變此程序也許是有必要的。

1. 輕輕顛倒瓶子使LSM充分混合

2. 無菌轉移3 ml LSM15 ml離心管中。

3. 混合2 ml去纖維蛋白血液或肝素化血液和2 ml 生理鹽水

4. 仔細的將稀釋血液加入含有3 ml LSM(室溫)的15ml離心管中,在血液和LSM中形成一個明顯的分層。不要將稀釋血液混合入LSM中。

5. 室溫下400xg離心15-30min,離心可以沉淀紅細胞和多形核白細胞,同時可以在LSM上形成一層單核**細胞,如上圖所示(具體分層情況為血漿層-單個核細胞層-LSM-RBC顆粒)。

6. 吸出**細胞上方2-3mm的血漿。

7. 吸取**細胞層以及它下面一半的LSM,并轉移到另外一個離心管。加入等體積的平衡鹽緩沖液至離心管內的**細胞層中,室溫(18-25°C)離心10分鐘,離心速度設定在既不損傷細胞又能沉淀細胞即刻,例如160 – 260 xg(清洗去除LSM,并降低血小板的百分比)。

8. 再用平衡鹽緩沖液清洗細胞,*后用適當的培養基重懸細胞。

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