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Percoll不連續密度梯度沉淀法分離純化**細胞和**母細胞
（一） 原理
Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低（<20mosm／kg H２O）, 粘度也很小，可形成高達1.3g／ml密度，采用預先形成的密度梯度時可在低離心力（200～1000g）于數分至數十分鐘內達到滿意的細胞分離結果。由于Percoll擴散常數低，所形成的梯度十分穩定。此外，Percoll不穿透生物膜，對細胞無毒害，因此廣泛用于分離細胞、亞細胞成分、**及病毒，還可將受損細胞及其碎片與完好的活細胞分離。
二）操作方法及注意事項 1.不同濃度（密度）Percoll溶液的制備: 先用9份Percoll與1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合達到生理性滲透壓，然后用生理溶液（0.85％ NaCl或0.15M PBS）稀釋到所需濃度。 Percoll濃度（％） 70 60 50 40 30 20 比重g／ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031
2.不連續密度梯度Percoll層的制備: 先將試管壁用牛血清濕潤，除去多余血清，這種預處理可使逐層疊加的Percoll液平穩沿管壁流下，使形成滿意的界面。在制備過程中一般用長針頭注射器從高密度向低密度逐層放置，有時相鄰兩層Percoll比重相差不大時，可將Percoll液放入注射器中，小針頭斜面緊貼管壁，任其自然慢慢流下。 3.裝樣：樣品體積和細胞濃度根據不同細胞而異，一般加樣體積不宜過大，細胞濃度也不可過高，否則會影響細胞的分離和回收。 4.離心：一般采用離心力為400g，時間20～25min。由于多層Percoll之間密度差別不大，因此離心機加速、降速時要慢，要平穩。 5.取樣：當所要分離的細胞絕大部分在兩層的界面時，可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細胞;有時大部分細胞位于Percoll層中,則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細胞經2次洗滌后可供培養或檢測用。 （三）分離純化細胞舉例 1.富含NK活性大顆粒**細胞（LGL）的純化:按順序由下向上逐層加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五種不同密度的Percoll,如用10ml試管（或塑料管）分離,每層Percoll約1.2～1.5ml，初步從外周血中分離的PBMC細胞1×10８懸于１ml培基中，按要求裝樣、離心和取樣。一般富含NK殺傷活性的LGL細胞位于42.5％與45％Percoll界面以及上下二層的Percoll液中。 2.純化**母細胞和除**細胞：分別疊加50％和30％Percoll液。收取經PHA（或其它抗原、有絲分裂原）刺激PBMC,或含有較高比例異型的PBMC（如腎綜合征出血熱患者），按要求裝樣、離心和取樣。位于管底的**細胞為小**細胞；兩層Percoll之間為**母細胞，純度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死細胞。收獲**母細胞可進行表型、結構以及功能的研究。
（四） 人不同血細胞的漂浮密度 表 人不同血細胞的漂浮密度 ──────────────┬────────────────── 細 胞 漂浮密度 │ 細 胞 漂浮密度 ──────────────┼────────────────── 紅細胞 1.09-1.11 │**細胞 1.052-1.077 粒細胞 │ B**細胞 1.062-1.075 嗜酸性 1.09-1.095 │ T**細胞 1.065-1.077 嗜中性 1.080-1.085 │ **母細胞 1.065-1.077 單核細胞 1.050-1.066 │自然殺傷細胞 1.050-1.070 血小板 1.030-1.060 │ ──────────────┴──────────────────
（五）問與答 問：請問percoll連續梯度怎么配制？比如15%---75%的percoll連續梯度? 答：根據你需要的具體密度梯度決定的，根據要分離的不同細胞種類，數量等等，也有用原液配的。也有用80％配的，不一定的。另外，percoll本身是低滲透壓的，要用高滲透壓溶液配成生理等滲透壓溶液，然后使用，不然，細胞容易破裂。一般是先用9份Percoll與1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合達到生理性滲透壓，然后用生理溶液（0.85％ NaCl或0.15M PBS）稀釋到所需濃度。即取Percoll原液與10倍濃縮的PBS以9：1的比例混合，此時溶液 為100％ Percoll，比重是1.127，毫克分子滲透壓濃度為290mOsmol/kg Percoll濃度（％） 70 60 50 40 30 20 比重g／ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031