动物骨髓单个核细胞分离液实验方法
技术文档编号：TBD0024SOP
【产品规格】
200ml/Kit
【产品组成】
为方便广大用户使用，试剂内容如下：
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名称
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产品编号
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规格
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A
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XXXX 动物骨髓单个核细胞分离液
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200ml
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B
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样本稀释液（赠品）
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2010C1119
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200ml
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C
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清洗液（赠品）
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2010X1118
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200ml
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D
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匀浆冲洗液（赠品）
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F2013TBD
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200ml
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E
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说明书
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1 份
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【实验前准备】
1. 适用仪器
*大离心力可达 1200g 的水平转子离心机
2. 无菌硅化离心管
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序号
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产品名称
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产品货号
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规格
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1
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无菌硅化离心管/10ml（随试剂盒附赠 5 支）
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TUB2015
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100 支/包
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【骨髓单细胞悬液的制备】
1. 以适当方式处死动物，剥离出股骨或胫骨，用剪刀剪断骨头两端，露出内腔。
2. 用注射器吸取适量（根据动物大小）的匀浆冲洗液（产品编号：F2013TBD）冲洗出内腔中的骨髓。
3. 收集悬液到合适离心管中，反复吹打成单细胞悬液，以 70µm 细胞筛网（产品编号：TBDTM-SC，随试剂盒附赠 5 个）过滤。
4. 450g，离心 10min，弃上清。
5. 用样本稀释液（产品编号：2010C1119）重悬细胞浓度为 2×108–1×109/ml 的单细胞悬液
备用（以小鼠为例，一般使用 1ml 样本稀释液重悬骨髓细胞）。
【检验方法】
全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。
1. 取一支适当离心管，加入与骨髓单细胞悬液等量的分离液（注：分离液*少不得少于
3ml）。
2. 用吸管小心吸取骨髓单细胞悬液加于分离液液面上，400-500g，离心 20-30min。（注：根据骨髓单细胞悬液量确定离心条件，骨髓单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到*佳分离效果）。
3. 离心后，此时离心管中由上至下分为四层。**层为稀释液层。**层为环状乳白色单个核细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。
4. 用吸管小心吸取**层环状乳白色单个核细胞层到另一 15ml 离心管中，向离心管中加入 10ml 清洗液（产品编号：2010X1118），混匀细胞。
5. 250g，离心 10min。
6. 弃上清。
7. 用吸管以 5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。
8. 250g，离心 10min。
9. 重复 7、8、9，弃上清后以 0.5ml 后续实验所需相应液体重悬细胞。
分离图例
【注意事项】
1. 全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。为获得*佳的实验结果，*好在取样 2h 内进行实验，样品存放时间越长，细胞分离效果越差。样品放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。
2. 本实验*好不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。
3. 吸取过多的单个核细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加。
4. 分离液用量大于骨髓单细胞悬液样本时，分离效果更佳。
5. 如实验后细胞得率或活性过低，请联系天津灏洋技术支持以寻求帮助，具体联系方式详见下方生产企业信息。
【储存条件及有效期】
常温保存，有效期 2 年。本品易感染**，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启封后置常温保存。如 4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。
【参考值（参考范围）】
本实验单个核细胞提取率及纯度大于 80%。
【相关实验技术方案】
1. 骨髓冲洗单细胞悬液制备技术。
2. 所获得单个核细胞的培养技术。
3. 所获得单个核细胞的核酸提取技术。
4. 所获得单个核细胞的鉴定方法A.流式细胞技术B.**组化技术
C.原位杂交技术
D.PCR 技术
【可能存在的问题及解决方法】
1. 由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示：
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出现情况
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出现原因
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建议解决方案
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离心后目的细胞存在于血浆层或稀释液层
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转速过小或离心时间过短
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适当增减转速
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离心后目的细胞存在于分离液中
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转速过大或离心时间过长
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离心后白环层弥散
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细胞密度过大
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调整细胞密度
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离心后白环层太浅或看不见
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细胞密度过小
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2. 本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心，其密度与温度、大气压等密切相关。不同地区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时，恒定离心时间，对离心转速进行调整。
3. 本分离液依照国际标准，全部使用药用级原料，性能指标与国产同类产品略有不同，可能出现红细胞沉降不完全的情况，可以适当加大离心转速。
注：在对离心条件进行调整时，离心转速的加减以 50-100g 为基数，直至达到*佳分离效果，离心力*小不得小于 400g，*大不得大于 1200g。离心时间以 20-30min 为准。