动物脏器组织单核细胞分离液实验方法

“XXXX”动物脏器组织单核细胞分离液实验方法

【产品规格】

2×200ml/Kit

【产品组成】

为方便广大用户使用，试剂内容如下：

【检验方法】

全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。

1.首先制备脏器组织单细胞悬液，制备方法详见“组织单细胞悬液制备技术”。

2.取一支 15ml 的离心管，依次小心加入试剂 A、试剂 D（体积比为 3:2，试剂总量与样本量相等。如脏器组织单细胞悬液为 5ml，则先后加入试剂 A 3ml、试剂 D 2ml），制成梯度界面，各液面分层一定要清晰。

3.用吸管小心吸取脏器单细胞悬液样本加于分离液液面上，400-550g，离心 20-30min（注：根据脏器单细胞悬液量确定离心条件，样本量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到*佳分离效果）。

4.离心后，此时离心管中由上至下分为五层。**层为稀释液层。**层为透明试剂 D 液层。第三层为环状乳白色单核细胞层。第四层为透明试剂 A 液层。第五层为红细胞层。

5.用吸管小心吸取**层试剂 D 层和第三层乳白色细胞层到另一 15ml 离心管中，往所得离心管中加入 10ml 清洗液（产品编号：2010X1118），混匀细胞。

6.250g，离心 10min。

7.弃上清。

8.用吸管以 5-10ml 清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。

9.250g，离心 10min。

10.重复 7、8、9，弃上清后以 0.5ml 后续实验所需相应液体重悬细胞。

差异贴壁法纯化细胞

（1）用单核细胞无血清培养基（产品编号：CTBD2011）或单核细胞完全培养基（产品编号：HCTBD2011）以 1.5-3×106 个/ml 的密度重悬细胞，将细胞铺于一次性细胞板或细胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。

（2）2-4 小时内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞）。

（3）10-24 小时内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。（4）不贴壁的为**细胞。注：

a）无血清培养基中不含任何动物成分，为得到更佳培养效果可添加 10%自体血浆或2-8%经灏洋筛选的胎牛血清。

b）完全培养基中含 2-20%胎牛血清（血清具体含量由所培养的目的细胞而定）。

c）由于每种细胞的贴壁时间存在差异可将所得细胞分开已达简单的纯化目的，此法成本相对较低。如需获得高纯度目的细胞则需在使用分离液后选用**磁珠阳性或阴性分选。

【注意事项】

1.全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。为获得*佳的实验结果，*好在取样 2h 内进行实验，样本存放时间越长，细胞分离效果越差。样本放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。

2.本实验*好不使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。

3.吸取过多的单核细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加。

4.分离液用量大于脏器组织单细胞悬液样本量时，分离效果更佳。

5.如实验后细胞得率或活性过低，请联系天津灏洋技术支持以寻求帮助，具体联系方式详见下方生产企业信息。

【储存条件及有效期】

18-25℃保存，有效期 2 年。本品易感染**，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启

封后置常温保存。如 4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

【参考值（参考范围）】

本实验单核细胞提取率大于 80%。

下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例，用户可适当进行参考。

【相关实验技术方案】

脏器组织单细胞悬液制备技术。

所获得单核细胞的培养技术。

所获得单核细胞的核酸提取技术。

所获得单核细胞的鉴定方法A.流式细胞技术B.**组化技术C.原位杂交技术

D.PCR 技术

【可能存在的问题及解决方法】

1.由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示：

2.本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心，其密度与温度、大气压等密切相关。不同地区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时，恒定离心时间，对离心转速进行调整。

3.本分离液依照国际标准，全部使用药用级原料，性能指标与国产同类产品略有不同，可能出现红细胞沉降不完全的情况，可以适当加大离心转速。

注：在对离心条件进行调整时，离心转速的加减以 50-100g 为基数，直至达到*佳分离效果，

离心力*小不得小于 400g，*大不得大于 1200g。离心时间以 20-30min 为准。