技术文章
首页 >>> 技术文章

流感病毒分离标准操作规程（SOP） 转
 病毒分离
分离病毒是诊断病毒性***常用，并且高度敏感的方法之一。分离出的病毒须经**
学、基因分析或电子显微镜等进一步鉴定确诊。病毒可长期保存，亦可用来作抗原性、
基因特性或**敏感性等分析。病毒分离亦受一定限制。目前用于分离病毒的组织细胞
种类有限，每种细胞只能用来分离培养一或数种病毒。MDCK（狗肾细胞）是目前用于分
离培养流感病毒*常用的细胞系。
分离流感病毒*常用的活体是鸡胚，目前有些实验室用MDCK细胞代替鸡胚分离培养流感
病毒。由于MDCK细胞属肿瘤细胞系，故用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。各实验
室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒，不应放弃用鸡胚分离病毒的方法。

流感病毒细胞分离标准操作规程

材料：1、细胞瓶或细胞管培养成片的MDCK细胞
2、TPCK处理胰酶（牛胰腺来源XIII型）Sigma Cat. # T-8642
3、HEPES 缓冲液, 1 M 母液 GIBCO BRL Cat. # 15630-023
4、D-MEM培养基，GIBCO BRL Cat. # 11965-092
5、青、链霉素母液（10,000 U/ml 青霉素 G; 10,000 ?g/ml 硫酸链霉素） ，GIBCO BRL
Cat. # 15140-023
6、牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液，GIBCO BRL Cat. # 15260-011
7、放置于2ml wheaton 小瓶中的临床样品
8、T-25培养瓶用于病毒培养，（组织培养管也可被应用，若样本量大的话应选用培养瓶
，细胞数量按规定调整。）
9、1ml 滴管
10、10ml 滴管
培养基和试剂的准备：（建议：要求经常检查试剂使用的有效期）
500 ml D-MEM液中加入：
青、链霉素母液5 ml （终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 100 ?g/ml 链霉素）
牛血清白蛋白12.5 ml （终浓度: 0.2 %）
HEPES缓冲液12.5 ml （终浓度: 25 mM）
病毒生长液：每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶（母液浓度为2m
g/ml ）使TPCK-胰酶的浓度为2 ?g/ml。
方法：（所有有关病毒分离的操作都应在生物**Ⅱ实验室中进行，必须遵守生物**
规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定。进入生物**Ⅱ实验室要求着必要的
个人防护用品：穿工作服、工作鞋、戴帽子、口罩和防护眼镜）

程序：
Ⅰ 细胞培养瓶的准备
1、显微镜检查细胞生长状态，40倍放大。
2、用病毒培养液替代细胞生长液，保证使用合适的病毒培养基。
3、轻轻倒出细胞生长液于广口瓶中，用6 ml of含2 ?g/ml of TPCK-胰酶的D-MEM液洗细
胞3遍。
Ⅱ 细胞培养瓶的接种
1、用无菌的移液管将D-MEM从细胞培养瓶中移出。
2、用无菌的移液管吸取200 ?l临床样品置于细胞培养瓶中。
3、接种物370C吸附30分钟。
4、加6 ml of含2 ?g/ml of TPCK-胰酶的不含小牛血清的完全D-MEM液于细胞培养瓶中。

5、每细胞培养物的收获日检测细胞病变。（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙
增大。细胞核固缩或破裂。严重时细胞部分或全部脱落）
Ⅲ 细胞培养物的收获
1、当细胞病变为3+或4+时，收获细胞悬液并加稳定剂如：甘油或终浓度为0.5%的牛血清
白蛋白。即使无细胞病变也应该于6-7天收获。
2、进行红细胞凝集实验并40C保存。如没有红细胞凝集现象在报告不能从样品中分离病
毒前，应再传代2-3次。
3、如果有必要，应3000转离心5分钟以去除剩余的细胞。通过血凝抑制实验鉴定分离物
，并在收获的**间将分离物保存在-70oC条件。

流感病毒鸡胚分离标准操作规程
材料：鸡胚10日龄
照卵灯
70%酒精
针头, 22 号, 1? 英寸
1ml注射器
鸡卵开孔器
胶水或清漆
15ml 管和架子
10ml 移液管
无菌镊子
方法：（所有有关病毒分离的操作都应在生物**Ⅱ实验室中进行，必须遵守生物**
规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定。进入生物**Ⅱ实验室要求着必要的
个人防护用品：穿工作服、工作鞋、戴帽子、口罩和防护眼镜）
程序：
I.验卵
1、用照卵灯检测鸡胚，并将鸡胚的盲端放置在蛋盘上。
2、如果鸡胚是没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应掉。
II.鸡胚接种
1、将鸡胚的盲端放置在蛋盘上，标记每个鸡胚用特定的鉴定数量（通常每个样本接种3
个鸡胚）。
2、用70%乙醇**鸡胚，在气室端钻孔。每份标本接种3个鸡胚。
3、用注射器吸1ml处理过的临床标本，装上22 号（ 1? 英寸）针头。
4、将鸡胚置于蛋架上，用短促动作刺破鸡胚羊膜，将100 ?l临床标本注入鸡胚羊膜腔。
将针头退出至? 英寸，将另外100 ?l临床标本注入鸡胚尿囊腔。
5、用同一注射器和针头将同一标本依上法接种另外的两枚鸡胚。
6、将针头弃于合适的生物**装置中。
7、滴石蜡或胶水封口。
8、33-34oC 温箱培养鸡胚2-3 天。
提示：禽流感需35?C or 37oC培养，哺乳动物流感病毒35oC培养（禽流感在35?C也会生
长良好！）
III.鸡胚收获
1、鸡胚在收获前应4oC过夜或至少放置4小时。
2、标记15ml 塑料管与相应的鸡胚编号一致。用70%乙醇**鸡胚顶部。
3、用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜。用10ml 吸管吸鸡胚尿囊液置于相
应的收集管中。用注射器和针头刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中。由于
羊水较少可以将3个鸡胚的羊水合并。
4、将鸡胚收获液3000转离心5分钟去除血液和细胞。进行红细胞凝集实验并4oC孵育30分
钟。如没有红细胞凝集现象在报告不能从样品中分离病毒前，应再鸡胚传代2次。
5、如果有必要，应3000转离心5分钟以去除剩余的细胞。通过血凝抑制实验鉴定分离物
，并在收获的**间将分离物保存在-70oC条件下。
注意事项
I.不要在-20oC条件下保存病毒分离物，应该温度条件下流感病毒极不稳定。
II.流感病毒实验室毒株和临床检测样本的交叉污染问题：流感病毒操作要求生物**规
程。当在同一工作区域内操作临床样本和已知流感病毒时应该有特殊警示。有些实验室
用已知的病毒作为阳性控制，而且有将商用推荐病毒作为质量确证程序。这些病毒由于
其极优的生长特性被选择出来。因此这些毒株常与临床检测样本发生交叉污染。*好在
流感流行季节前准备该类病毒。如果在此期间必须补充这类病毒的话，必须与处理临床
标本的时间分开。应尽量将已知病毒和未知材料在不同时间、不同生物**柜、不同房
间进行操作。
：
III.实验室污染的鉴定：由于试验室已知毒株和商用推荐病毒都是实验室适应的，有良
好的生长特性，通常滴度较高。用推荐血清做抗原分析和基因序列分析可以确定污染状
况。

重要原则：
禁止在同一实验室，同一时间处理接种未知临床标本和已知标准病毒。
禁止在同一实验室，同一时间处理接种采自不同动物的标本；动物标本（如猪、禽等）
必须与人的标本分别保存。
上一篇：Percoll 细胞分离液说明书（GE）
下一篇：针头过滤器膜的选择