◆ 标本收集 对于石蜡包埋的组织,活检或手术切除标本应在2小时内取材或固定,避免组织自溶及抗原变性等影响**组化结果。对于冰冻切片的组织,取材后应立即放入液氮冷冻,然后放入-80℃保存。取材时应保持所检标本原有的结构、形态,为避免挤压组织,尽量使用锋利刀片,并且避开坏死组织,除取病灶或含待检抗原部位外,还应取病灶与正常交界处,即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区,以形成自身对照。
◆常用固定液 1.单纯固定液 ● 4%中性甲醛固定液:*常用的固定液,能满足常规HE及**组化、PCR等工作。一般无特殊要求的病理标本均适用。尤其值得注意的是,中性甲醛是以pH7.2~7.4的磷酸缓冲液为溶剂配制的,其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4%甲醛固定液。此固定液配制后应密封并保存在阴凉处,保存时间不超过一个月。 --甲醛(40%) 100 ml --无水磷酸氢二钠 6.5 g --磷酸二氢钠 4.0g --蒸馏水 900 ml ● 乙醇固定液:使用时以80%~95%的浓度为宜,具有硬化、固定、脱水等作用,对组织渗透力较弱,因此很少单独使用,但其保存组织中的核酸强于中性甲醛,故常用于有核酸操作的实验或检查,如果用于证明尿酸结晶和保存糖原,可用100%乙醇固定组织。 ● 4%的多聚甲醛:主要用于培养细胞的固定,动物灌注固定及后固定(动物器官经该液灌注后,然后取材,再用该液浸泡2~24小时)也常选该固定液固定。
2.混合固定液 ● 乙醇一甲醛(乙醇-福尔马林,AF)固定液:适用于皮下组织中肥大细胞的固定。该固定液有固定兼脱水作用,固定后的标本可直接入95%乙醇脱水。 --甲醛(40%) 100 ml --95%乙醇 900 ml ● B5(醋酸钠-升汞-甲醛)固定液:多用于固定**组织。染色前应进行脱汞沉淀处理。 --无水醋酸钠 1.25 g --升汞 6.0 g --蒸馏水 90 ml --使用前加入甲醛 10 ml ● Bouin固定液:特别适用于睾丸活检组织的固定。Bouin液对组织固定较均匀,收缩很少,不会使组织变硬变脆。需现配现用。 --饱和苦味酸水溶液(约1.22%) 75 ml --甲醛 25 ml --冰醋酸 5 ml ● Carnoy固定液:穿透能力强,可很好的固定细胞质和细胞核,特别适合于固定外膜致密的组织,亦适用于糖原及尼氏小体的固定。 --无水乙醇 60 ml --氯仿 30 ml --冰醋酸 10 ml ● Zenker固定液:经此液固定的标本,细胞核和细胞质染色颇为清晰,但成本较昂贵且需特殊处理汞。该固定液要避免接触阳光,以免引起化学变化而失效。 --升汞 5.0 g --重铬酸钾 2.5 g --硫酸钠 1.0g --蒸馏水(加至) 100 ml
◆蜡块制备 ● 固定(对于石蜡包埋的组织,一般用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻组织,一般采用冰冻丙酮,但对于不同的组织和抗原,可选用不同的固定液,应根据具体情况而定); ● 脱水浸蜡(75%乙醇90~120min,85%乙醇90min,95%乙醇Ⅰ40min,95%乙醇Ⅱ40min,,无水乙醇Ⅰ30min,无水乙醇Ⅱ30min,二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min(可视观察结果而定),石蜡Ⅰ60min,石蜡Ⅱ60min); ● 包埋(铁板架包埋或其他容器,有时要求快速冷却。)
◆石蜡切片 连续切片,切片厚2~4μm,按序贴在玻片的下1/3。52~60℃烤片18h。切片可在4℃保存数年(石蜡切片)。
◆冰冻切片 将术中送检组织取材后,置于恒冷箱冰冻切片机切片架上,待组织块冷冻变硬后切片,厚度为3~7μm。将切片贴附在载玻片上,空气中稍风干(1~2min),后放入固定液中固定。